Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

Un instrument RMN 900MHz avec un 21,1 T aimant à HWB-RMN, Birmingham, Royaume-Uni

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, plus connue sous le nom de spectroscopie de RMN est une technique de recherche qui exploite les magnétiques propriétés de certains noyaux atomiques . On détermine les propriétés physiques et chimiques des atomes ou des molécules dans lesquelles elles sont contenues. Elle se appuie sur le phénomène de résonance magnétique nucléaire et peut fournir des informations détaillées sur la structure, la dynamique, l'état de réaction, et l'environnement chimique de molécules.

Le plus souvent, la spectroscopie RMN est utilisée par les chimistes et biochimistes pour étudier les propriétés de molécules organiques , même si elle est applicable à tout type d'échantillon qui contient des noyaux possédant essorage. Des échantillons appropriés vont de petits composés analysés avec une dimensions proton ou carbone 13 spectroscopie RMN à de grandes protéines ou acides nucléiques utilisant trois ou quatre dimensions techniques. L'impact de la spectroscopie RMN sur les sciences a été considérable en raison de la gamme de l'information et la diversité des échantillons, y compris les solutions et solides.

Des techniques de RMN de base

L'échantillon de RMN est préparé dans un tube à paroi mince verre - un Tube de RMN.

Lorsqu'il est placé dans un champ magnétique, RMN des noyaux actif (tel que ¹ H ¹³ ou C) absorbe un rayonnement électromagnétique à une caractéristique de fréquence de l' isotope . La fréquence de résonance, l'absorption de l'énergie et l'intensité du signal est proportionnelle à la force du champ magnétique. Par exemple, dans une 21 Champ magnétique Tesla, protons résonner à 900 MHz. Il est courant de se référer à un aimant 21 T comme un 900 Aimant MHz, bien que différents noyaux résonnent à une fréquence différente à cette intensité de champ en proportion de leur les moments magnétiques nucléaires.

Déplacement chimique

Une charge de filage génère un champ magnétique qui se traduit par un moment magnétique proportionnelle à la rotation. En présence d'un champ magnétique extérieur, deux états de spin existent (par un noyau de spin 1/2): une rotation et une rotation vers le bas, où une aligne avec le champ magnétique et l'autre s'y oppose. La différence dans l'énergie (AE) entre les deux états de spin augmente que la force du champ augmente, mais cette différence est généralement très faible, conduisant à l'exigence de puissants aimants RMN (1-20 T pour les instruments modernes RMN). Irradiation de l'échantillon avec une énergie correspondant à la séparation de l'Etat de spin exacte d'un ensemble spécifique de noyaux va provoquer une excitation de ceux ensemble de noyaux dans l'état d'énergie plus faible à l'état d'énergie plus élevée.

Pour spin 1/2 noyaux, la différence d'énergie entre les deux états de spin à une intensité de champ magnétique donné sont proportionnelles à leurs moments magnétiques. Cependant, même si tous les protons ont les mêmes moments magnétiques, ils ne donnent pas de signaux de résonance aux mêmes valeurs du champ / fréquence. Cette différence résulte des différents environnements électroniques du proton. Lors de l'application d'un champ magnétique externe, ces électrons se déplacent en réponse au champ et génèrent des champs magnétiques locaux se opposant au champ appliqué beaucoup plus forte. Ce champ locale ainsi "boucliers" le proton du champ magnétique appliqué, qui doit donc être augmenté afin de parvenir à résonance (absorption de l'énergie de rf). Ces incréments sont très faibles, habituellement en parties par million (ppm). La différence entre 2.3487T et 2.3488T est donc d'environ 42ppm. Cependant, une échelle de fréquence est couramment utilisé pour désigner les signaux de RMN qui, même si le spectromètre peut fonctionner en balayant le champ magnétique, et donc la 42 ppm est 4200 Hz pour une fréquence de référence de 100 MHz (haute fréquence).

Toutefois, étant donné que l'emplacement des différents signaux de RMN qui dépend de l'intensité du champ magnétique externe et la fréquence HF, les signaux sont généralement rapportés par rapport à un signal de référence, généralement celui de TMS ( tétraméthylsilane). De plus, puisque la distribution des signaux de RMN qui est dépendant champ, ces fréquences sont divisées par la fréquence du spectromètre. Cependant, puisque nous divisons Hz par MHz, le nombre résultant serait trop petit, et donc il est multiplié par un million. Cette opération donne donc un certain nombre de repérage appelé le "déplacement chimique" avec des unités de parties par million. Pour détecter ces différences de fréquence faible du champ magnétique appliqué doit être constant dans tout le volume de l'échantillon. Haute résolution spectromètres RMN utilisent des cales pour régler l'homogénéité du champ magnétique de parties par milliard ( ppb) dans un volume de quelques centimètres cubes. En général, les déplacements chimiques pour les protons sont très prévisible puisque les changements sont principalement déterminés par des effets de blindage plus simples (de densité d'électrons), mais les déplacements chimiques pour de nombreux noyaux plus lourds sont plus fortement influencés par d'autres facteurs, y compris des états excités ("paramagnétique" contribution à blindage tenseur).

Exemple de déplacement chimique: spectre de hexaborane B ₆ H ₁₀ présentant des pics de RMN décalé en fréquence, ce qui donne des indices quant à la structure moléculaire. (Cliquez pour lire les détails d'interprétation)

Le déplacement chimique fournit des informations sur la structure de la molécule. La conversion des données brutes de ces informations est appelé attribution du spectre. Par exemple, pour le spectre ¹ H-RMN de l'éthanol (CH ₃ CH ₂ OH), on se attendrait à des signaux à chacun des trois déplacements chimiques spécifiques: une pour le groupe C H _3, une pour le groupe C H ₂ et une pour le groupe O H. Un groupe typique CH ₃ présente un décalage d'environ 1 ppm, un CH ₂ OH attaché à un a un décalage d'environ 4 ppm et un groupe OH a un décalage d'environ 2 à 3 ppm en fonction du solvant utilisé.

En Spectroscopie RMN paramagnétique, les mesures sont effectuées sur des échantillons paramagnétiques. Le paramagnétisme donne lieu à des déplacements chimiques très diverses. En spectroscopie RMN 1H, la plage de décalage chemcial peut se étendre sur 500 ppm.

En raison du mouvement moléculaire à la température ambiante, les trois protons méthyliques en moyenne au cours de la durée de l'expérience RMN (qui exige typiquement quelques mlle). Ces protons deviennent dégénérer et former un pic à la même déplacement chimique.

La forme et la surface des pics sont des indicateurs de la structure chimique aussi. Dans l'exemple ci-dessus, le spectre de _{l'éthanol-CH3} pic du proton a trois fois l'aire du pic comme OH. De même, le pic ₂ CH serait deux fois la surface du pic OH mais seulement 2/3 de la zone de la pointe CH _3.

Le logiciel permet l'analyse de l'intensité du signal de pics, qui dans des conditions de relaxation optimale, en corrélation avec le nombre de protons de ce type. L'analyse de l'intensité du signal se fait par l'intégration mathématique de processus qui calcule l'aire sous une courbe. L'analyste doit intégrer la crête et pas mesurer sa hauteur parce que les pics ont aussi largeur -et donc sa taille dépend de sa zone non sa hauteur. Toutefois, il convient de mentionner que le nombre de protons, ou toute autre noyau observé, ne est proportionnelle à l'intensité, ou l'intégrale du signal de RMN dans les expériences de RMN très simples à une dimension. Dans des expériences plus élaborées, par exemple, des expériences généralement utilisés pour obtenir 13 Les spectres de RMN du carbone, de l'intégrale des signaux dépend de la vitesse du noyau de relaxation, et de ses constantes de couplage dipolaire et scalaires. Très souvent, ces facteurs sont mal connus - donc, l'intégrale du signal de RMN est très difficile à interpréter dans des expériences de RMN plus compliquées.

Couplage J

Exemple ¹ H spectre (une dimension) de la RMN de l'éthanol en tant que signal tracé intensité en fonction déplacement chimique. Il existe trois types différents de H dans de l'éthanol atomes concernant RMN. L'hydrogène (H) sur la Groupe -OH ne est pas le couplage avec les autres atomes de H et apparaît comme un singulet, mais la CH ₃ - et le CH ₂ - hydrogènes sont couplage avec l'autre, résultant en un triplet et quatuor respectivement.

Certaines des informations plus utiles pour la détermination de la structure dans un spectre RMN monodimensionnel provient de couplage J ou couplage scalaire (un cas particulier de couplage spin-spin) entre les noyaux actifs de RMN. Ce couplage résulte de l'interaction de différents états de spin à travers les liaisons chimiques d'une molécule et conduit à la séparation des signaux de RMN. Ces modèles de fractionnement peuvent être simple ou complexe et, de même, peut être carrément interprétable ou trompeuse. Ce couplage fournit un aperçu détaillé de la connectivité des atomes dans une molécule.

Couplage à n équivalent (spin ½) noyaux divise le signal en un n 1 multiplet avec des ratios d'intensité suivant le triangle de Pascal comme décrit sur la droite. Couplage à spins supplémentaires entraînera de nouvelles lamelles de chaque composant du multiplet par exemple le couplage à deux noyaux de spin ½ différente avec sensiblement différentes constantes de couplage vont conduire à un doublet de doublets (abréviation: dd). Notez que le couplage entre les noyaux qui sont chimiquement équivalente (ce est-ont le même déplacement chimique) n'a pas d'effet sur les spectres RMN et raccords entre les noyaux qui sont éloignés (généralement plus de trois liaisons à part pour les protons dans les molécules flexibles) sont généralement trop petits pour provoquer splittings observables. accouplements à longue portée sur plus de trois liaisons peuvent souvent être observés dans cyclique et composés aromatiques, conduisant à d'autres modèles de fractionnement complexes.

Par exemple, dans le spectre de proton pour l'éthanol décrite ci-dessus, le groupe CH ₃ est divisé en un triplet avec un rapport d'intensité de 1: 2: 1 par les deux voisins CH ₂ protons. De même, le groupe CH ₂ est divisé en un quartet avec un rapport d'intensité de 1: 3: 3: 1 par les trois voisins CH ₃ protons. En principe, les deux protons CH ₂ seraient également divisés à nouveau en un doublet pour former un doublet de quartets par le proton d'un groupe hydroxyle, mais échange intermoléculaire du proton acide hydroxy se traduit souvent par une perte de couplage d'informations.

Couplage à chaque tour ½ noyaux tels que le phosphore-31 ou le fluor-19 œuvres de cette façon (bien que les ordres de grandeur des constantes de couplage peuvent être très différents). Mais les modes de fractionnement diffèrent de ceux décrits ci-dessus pour les noyaux de spin supérieure à ½ parce que le nombre quantique de spin a plus de deux valeurs possibles. Par exemple, le couplage à deutérium (un spin 1 noyau) divise le signal en un 1: 1: 1 triplet parce que le spin 1 a trois états de spin. De même, un noyau de spin 3/2 divise un signal dans un mélange 1: 1 quartet et ainsi de suite: 1: 1.

Accouplement combiné avec le déplacement chimique (et l'intégration des protons) nous apprend pas seulement de l'environnement chimique des noyaux, mais également le nombre de noyaux actifs de RMN voisins au sein de la molécule. Dans les spectres plus complexes avec de multiples pics à des déplacements chimiques dans les spectres similaires ou des noyaux autres que l'hydrogène, le couplage est souvent la seule façon de distinguer les différents noyaux.

Couplage de second ordre (ou fort)

La description ci-dessus suppose que la constante de couplage est faible en comparaison avec la différence de fréquences entre les spins RMN de non équivalents. Si la séparation de changement diminue (ou la force de couplage augmente), les diagrammes d'intensité multiplet sont d'abord déformées, puis deviennent plus complexes et analysé moins facilement (surtout si plus de deux tours sont impliqués). Intensification de quelques pics dans un multiplet est obtenue au détriment du reste, qui parfois presque disparaître dans le bruit de fond, bien que la zone intégrée sous les pics reste constante. Dans la plupart des haut champ RMN, cependant, les distorsions sont généralement modestes et les distorsions caractéristiques (toiture) peuvent en effet aider à identifier les pics connexes.

Effets de second ordre diminuent à mesure que la différence de fréquence entre multiplets augmente, de sorte que haut champ (ce est à dire à haute fréquence) affichage de spectres RMN moins de distorsion que les spectres de fréquence inférieure. Spectres tôt à 60 MHz étaient plus sujettes à des distorsions de spectres de machines d'exploitation ultérieures généralement à des fréquences à 200 MHz ou plus.

Inéquivalence magnétique

Des effets plus subtils peuvent se produire si chimiquement équivalentes tours (c.-à noyaux liés par symétrie et afin d'avoir la même fréquence RMN) ont des relations de couplage de spins externes. Spins qui sont chimiquement équivalente, mais ne sont pas impossibles à distinguer (en fonction de leurs relations de couplage) sont appelés magnétiquement inéquivalentes. Par exemple, les 4 sites H de 1,2-dichlorobenzène diviser en deux paires chimiquement équivalents par symétrie, mais un membre individuel d'une des paires comporte différents raccords aux spins qui constituent l'autre paire. Inéquivalence magnétique peut conduire à des spectres très complexe qui ne peut être analysé par modélisation informatique. Ces effets sont plus fréquents dans les spectres de RMN des systèmes non-flexibles aromatiques et autres, alors que la moyenne de conformation sur les liaisons CC dans les molécules flexibles tend à égaliser les couplages entre protons sur des carbones adjacents, réduire les problèmes avec inéquivalence magnétique.

spectroscopie de corrélation

spectroscopie de corrélation est l'un des plusieurs types de résonance magnétique nucléaire (RMN) bidimensionnelle ou 2D-RMN. Ce type d'expérience RMN est mieux connu par son acronyme, COSY. Autres types de RMN bidimensionnelle comprennent J-spectroscopie, l'échange spectroscopie (EXSY), Spectroscopie Overhauser nucléaire d'effet (NOESY), spectroscopie de corrélation totale (TOCSY) et des expériences de corrélation hétéronucléaires, comme HSQC, HMQC, et HMBC. Les spectres de RMN à deux dimensions fournissent des informations sur une molécule de spectres de RMN à une dimension et sont particulièrement utiles dans la détermination de la structure d'une molécule , en particulier pour des molécules qui sont trop compliqués pour fonctionner avec une dimension en utilisant la RMN. La première expérience en deux dimensions, COSY, a été proposé par Jean Jeener, professeur à l'Université Libre de Bruxelles, en 1971. Cette expérience a été plus tard mis en œuvre par Walter P. Aue, Enrico Bartholdi et Richard R. Ernst, qui a publié leur travail en 1976.

Résonance magnétique nucléaire à l'état solide

Une variété de circonstances physiques ne permettent pas de molécules à étudier en solution, et en même temps non par d'autres techniques spectroscopiques à un niveau atomique, soit. En milieu en phase solide, tels que des cristaux, des poudres microcristallines, des gels, des solutions anisotropes, etc., il est en particulier le couplage dipolaire et anisotropie décalage chimique qui devient dominant pour le comportement des systèmes de spins nucléaires. En spectroscopie RMN classique état de solution, ces interactions supplémentaires conduiraient à un élargissement significatif de lignes spectrales. Une variété de techniques permet d'établir des conditions à haute résolution, qui peut, au moins pour les ¹³ C spectres, être comparables aux spectres RMN de l'état de solution.

Deux concepts importants à haute résolution pour la spectroscopie RMN à l'état solide sont la limitation de la possible orientation moléculaire par l'orientation de l'échantillon, et la réduction des interactions magnétiques nucléaires anisotropes par exemple la filature. De cette dernière approche, tourne très vite autour de la angle magique est une méthode très importante, lorsque le système comprend spin 1/2 noyaux. Un certain nombre de techniques intermédiaires, avec des échantillons d'alignement partiel ou à mobilité réduite, est actuellement utilisé dans la spectroscopie RMN.

Applications dans lesquelles l'état solide effets RMN se produisent sont souvent liées à la structure des enquêtes sur les protéines membranaires, fibrilles de protéines ou de toutes sortes de polymères, et l'analyse chimique en chimie inorganique, mais aussi inclure des applications «exotiques» comme les feuilles des plantes et des piles à combustible.

Spectroscopie RMN biomoléculaire

Protéines

Une grande partie de l'innovation au sein de la spectroscopie RMN a été dans le domaine des protéines Spectroscopie RMN, une technique importante dans la biologie structurale. Un objectif commun de ces enquêtes est d'obtenir haute résolution structures en 3 dimensions de la protéine, similaires à ce qui peut être atteint par Cristallographie aux rayons X. Contrairement à la cristallographie aux rayons X, la spectroscopie de RMN est habituellement limitée à des protéines plus petites que 35 kDa, bien que de plus grandes structures ont été résolus. Spectroscopie RMN est souvent le seul moyen d'obtenir des informations de haute résolution sur partiellement ou totalement protéines intrinsèquement non structurées. Ce est maintenant un outil commun pour la détermination de Les relations conformation d'activité où la structure avant et après interaction avec, par exemple, un médicament candidat est comparée à l'activité biochimique connue. Les protéines sont ordres de grandeur plus grand que les petites molécules organiques évoqués plus haut dans cet article, mais les techniques de base de RMN et certains de la théorie se applique également RMN. En raison du nombre beaucoup plus élevé d'atomes présents dans une molécule de protéine par rapport à un petit composé organique, les spectres 1D encombré de base deviennent des signaux qui se chevauchent dans une mesure où l'analyse de spectres directe devient inacceptable. Par conséquent, les expériences multidimensionnelles (2, 3 ou 4D) ont été conçus pour faire face à ce problème. Pour faciliter ces expériences, il est souhaitable d' isotopes étiqueter la protéine avec ¹³ C et ¹⁵ N, car le prédominant isotope naturel ¹² C ne est pas actif en RMN, alors que le moment quadrupolaire nucléaire du ¹⁴ N isotope prédominant naturellement empêche informations de haute résolution à obtenir à partir de cet isotope d'azote. La méthode la plus importante utilisée pour la détermination de structure des protéines Utilise Expériences NOE pour mesurer les distances entre les paires d'atomes dans la molécule. Par la suite, les distances obtenues sont utilisées pour générer une structure 3D de la molécule par la résolution d'un problème de géométrie à distance.

Acides nucléiques

«Acide nucléique RMN" est l'utilisation de la spectroscopie RMN pour obtenir des informations sur la structure et la dynamique de poly des acides nucléiques tels que l'ADN ou ARN. En 2003, près de la moitié de toutes les structures d'ARN connus avait été déterminée par spectroscopie RMN.

L'acide nucléique et la spectroscopie de RMN des protéines sont similaires, mais des différences existent. Les acides nucléiques ont un pourcentage plus faible d'atomes d'hydrogène, les atomes qui sont généralement observés en spectroscopie RMN, et que acides nucléiques doubles hélices sont raides et à peu près linéaire, ils ne se replient sur eux-mêmes pour donner corrélations "longue portée". Les types de RMN généralement fait avec des acides nucléiques sont ¹ H RMN du proton ou, ¹³ C-RMN, RMN ¹⁵ N, et ³¹ P RMN. Bidimensionnelle méthodes de RMN sont presque toujours utilisés, tels que la spectroscopie de corrélation (COSY) et la spectroscopie de transfert de cohérence totale (TOCSY) afin de détecter les raccords traversants nucléaires liaison, et spectroscopie nucléaire à effet de Overhauser (NOESY) pour détecter des couplages entre noyaux qui sont proches les uns des autres dans l'espace.

Paramètres prises à partir du spectre, cross-essentiellement de pics NOESY et les constantes de couplage, peuvent être utilisés pour déterminer les caractéristiques structurales locales telles que angles de liaison glycosidique, angles dièdres (en utilisant le Équation Karplus) et plisser de sucre conformations. Pour la structure à grande échelle, ces paramètres locaux doivent être complétées par d'autres hypothèses ou des modèles structurels, car les erreurs ajouter que la double hélice est traversée, et contrairement aux protéines, la double hélice ne ont pas un intérieur compact et ne se replie pas en arrière sur lui-même. RMN est également utile pour enquêter sur des géométries non standard tels que hélices pliées, non-appariement de bases de Watson-Crick, et empilement coaxial. Il a été particulièrement utile pour sonder la structure des oligonucleotides d'ARN naturels, qui ont tendance à adopter des conformations complexes tels que souches boucles et pseudonoeuds. RMN est également utile pour sonder la liaison de molécules d'acide nucléique avec d'autres molécules, telles que des protéines ou des drogues, en voyant les résonances qui sont décalées sur la liaison de l'autre molécule.

Glucides

Spectroscopie RMN glucides aborde les questions concernant la structure et la conformation des hydrates de carbone .